细胞培养必备知识很多科研伙伴第一次接触细胞时，都会感到紧张和兴奋。他们想尝试，又害怕犯错。所以小艺整理了一个细胞培养的必备知识，希望能帮助每一个科研实验者少走弯路。

01什么是细胞培养？细胞培养是指模拟内部环境(无菌、适宜的温度、pH和某些营养条件等)的方法。)在体外使其存活、生长、繁殖并维持其主要结构和功能。细胞培养也叫细胞克隆技术，生物学上的正式术语是细胞培养技术。无论对于整个生物工程技术还是生物克隆技术之一，细胞培养都是必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以是简单的单细胞，也可以是经过大量细胞培养后的少数分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，细胞培养本身就是细胞克隆。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中一项重要且常用的技术。通过细胞培养可以获得大量细胞，也可以用于研究细胞信号转导、细胞合成代谢、细胞生长和增殖。通过细胞培养，可以获得大量具有相同特性的细胞，从而研究细胞的形态结构、化学成分、功能和机制。

02细胞培养新手必看

01细胞培养无菌操作准备提前开启紫外线照射30分钟进行消毒灭菌，打开灯通风工作台10分钟，用75%酒精擦拭台面，开启洁净工作台风扇数分钟后开始实验操作。每次操作只处理一种细胞株，以避免细胞间的交叉污染。实验结束后，将实验物品取出工作台，再次用75%酒精擦拭无菌手术台。实验应在中心无菌区进行，一般不在边缘区。充足的物资在开始细胞培养前，检查移液器和瓶子的数量是否充足，避免开始实验后再次进出控制台，可以降低细胞污染的风险。细胞培养基也应该首先预热。只需对培养基的一部分进行预热，而不是整瓶预热，这样不仅可以节省实验时间，还可以避免培养基反复加热导致蛋白质的降解。手术后要尽量避光。

定期检查细胞培养定期检查培养细胞的形态，即形状和外观，对细胞培养实验的成功至关重要。a .检查培养液的颜色和透明度，颜色变黄，说明PH值降低；变成红色或紫红色，说明PH值升高，细胞生长停滞，死亡。一般生长稳定的细胞可以2-3天换一次，生长缓慢的细胞可以3-4天换一次。观察细胞的生长状态。细胞覆盖80-90%的瓶底，应及时传代。c .观察细胞的形态变化，以细胞透明度高、折光性强、轮廓清晰为佳。除了确认细胞的健康状态，还可以在每次操作时用肉眼和显微镜检查细胞，及早发现污染的迹象，防止污染扩散到实验室的其他细胞。注意微生物污染，常造成培养液浑浊，液体中漂浮菌丝或细胞细菌，不仅是微生物，还包括混入培养环境中的一切有害成分和引起细胞杂质的外来物质和细胞。

细胞劣化的迹象细胞劣化的迹象包括核周围出现颗粒、细胞从基质中分离以及细胞质空泡的形成。这些变质的迹象可能是由多种原因引起的，如培养物污染、细胞系老化或培养基中的有毒物质，或者这些迹象只是表明培养基需要更换。严重恶化时，就会变得不可逆转。

04细胞培养通风柜的消毒与布置a .保持细胞培养通风柜整洁有序，所有物品放在直视范围内。b .对通风柜内放置的所有物品喷洒70%乙醇，擦拭干净消毒。c .放置细胞培养容器

05培养瓶/皿等的无菌操作。无菌培养瓶、试剂瓶、培养皿等。只有在使用时才能揭开，并且不得暴露在环境中。操作完成后尽快盖好，取下时盖口朝下放在工作台上。无菌操作时不要说话、唱歌或吹口哨。尽快完成实验，尽可能避免污染。

06细胞培养中可能存在的污染物细胞培养污染物主要分为两类：a .化学污染物，如培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂、去污剂等。b .生物污染物，如细菌、霉菌、酵母菌、病毒、支原体等细胞系的交叉污染。充分了解污染源，采用良好的无菌技术，可以降低污染的频率和严重程度。细胞污染的筛查细胞被污染的途径有以下几种：a .空气是微生物传播的最主要途径，操作时尽量避免说话、咳嗽、打喷嚏；b .使用过的培养设备和器具未彻底清洗消毒；c .培养两种以上细胞时，操作不规范，可能导致细胞交叉污染；d .血清有问题，生产时可能被支原体或病毒污染；e .原代培养的污染大部分来自组织样本。

07交叉污染的确认虽然交叉污染不像微生物污染那样普遍，但与HELA细胞和其他快速生长的细胞系的广泛交叉污染是一个确定的问题，会造成严重的后果。从信誉良好的细胞库中获得细胞系，定期检查细胞系的特性并采用良好的无菌技术有助于避免交叉污染。DNA指纹、核型分析、同位素分析可以确认是否存在交叉污染。

08细胞换液注意事项：为细胞换液时，要沿着培养瓶的一侧轻轻加入，不要直接加入细胞中，以免损伤细胞，尤其是培养的细胞株比较脆弱时。使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体时，每根吸管只能使用一次，以避免交叉污染。

09细胞传代时间认为当细胞呈指数级增殖时，单层培养的细胞已经占据了所有可利用的底物，没有扩增的空间，或者悬浮培养的细胞已经超过了培养底物所能支持的容量，无法进一步生长，细胞增殖速率就会大大降低，甚至完全停止。

10细胞培养中使用抗生素的注意事项细胞培养中不宜长期使用抗生素，因为持续使用抗生素会促进抗生素耐药细胞系的产生，导致轻度污染的持续。抗生素只能作为短时间处理污染的最后手段，尽快清除。如果长期使用抗生素，应同时进行无抗生素培养，以作为对照鉴别隐性感染。

1细胞冻存的必要性连续培养的细胞系容易发生遗传漂变，有限的细胞系最终会老化。所有培养的细胞都容易受到微生物污染，即使运行最好的实验室也会遇到设备故障的问题。由于已建立的细胞系是一种宝贵的资源，因此更换细胞系的成本很高，需要花费时间。所以一定要冷冻保存很久。

2细胞冻存的事项细胞培养和冻存应在高细胞浓度下进行，细胞传代次数尽量少。冷冻保存前确保活细胞百分比至少为90%。请注意，最佳冷冻保存条件取决于所用的细胞系。冷冻保存和复苏会对大部分细胞产生不良影响，所以不要摇晃或使用涡旋。细胞培养无小事，每一步都需要操作者细心对待。为了养好细胞，我们需要对细胞的各种习性了如指掌，选择优质的血清和培养基有助于事半功倍。